HPV asociované cervikální léze

Přímé metody

Elektronová mikroskopie

Použitelnost této metody je omezená nejenom díky náročnosti jejího provedení.

Maturované papillomavirové partikule lze nalézt pouze v keratinizujících buňkách povrchových vrstev epitelu benigních lézí (například kožních a pohlavních bradavic), obvykle jsou nalézány v charakteristickém uspořádání v jádře buněčném, u odlučujících se keratinocytů s narušenou strukturou buňky a porušenou jadernou membránou i v cytoplazmě.

Imunohistochemie

Přímé munohistochemické (IHC) metody průkazu HPV využívají reakci polyklonálních nebo monoklonálních protilátek s časnými nebo pozdními papillomavirovými proteiny.

Molekulárně biologické metody

Pro účely klinické diagnostiky se tímto pojmem rozumí především metody detekce HPV DNA, pro úplnost lze uvést, že zatím spíše pro výzkumné účely se používají metody detekce mRNA a metody průkazu virových a buněčných proteinů, které vedou k charakteristice expresního profilu buňky v jednotlivých stádiích infekce a co nejúplnějšímu poznání procesu onkogenní transformace buňky a v konečném výsledku k nejúčinnější prevenci a léčbě.

Volba metod HPV DNA detekce závisí na požadovaném výsledku, metody zavedené laboratoří na základě publikací nebo vlastního výzkumu se označují jako „in-home“ metody, pro rutinní klinickou diagnostiku je vhodný některý z komerčních kitů.

Rutiní metody

Pro rutinní preventivní a diagnostický screening cervikálních lézí obvykle plně postačuje určení HPV negativity nebo HPV pozitivity, v případě pozitivity určení přítomnosti některého typu ze skupiny HR HPV, případně podle charakteru léze i LR HPV.

Nejpoužívanější metodou je

Hybrid Capture II systém (Digene),
který používá pro hybridizaci RNA sondy jak pro skupinu HR HPV typů (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68 ), tak pro skupinu LR HPV typů ( 6,11,42,43,44 ).

Jeho podstatou je metoda založená na přímé hybridizaci HPV DNA. Její princip spočívá v tom, že buňky cervikálního stěru se převedou do formy buněčné suspenze, narušením buněčných stěn se zpřístupní v buňkách potenciálně přítomná HPV DNA pro navázání – hybridizaci specifické skupiny sond a vzniklé hybridy se detekují pomocí specifických protilátek konjugovaných s příslušným detekčním enzymem, v tomto případě nejčastěji za použití chemiluminiscenčního substrátu. Pro zvýšení citlivosti detekce se využívá metoda amplifikce signálu, tím se tato metoda stává srovnatelně citlivou s detekcí na bázi PCR.Touto metodou lze podle některých publikací detekovat přítomnost papillomavirů s citlivostí již od 1pg HPV DNA/ml.

Přístroj Obr. Přístrojové vybavení pro metodiku HCII, Digene přístroje I

Dalším možným způsobem ve výjimečném případě, že je požadováno přesné určení typu je metodika na bázi PCR – v současnosti poměrně používaná a v několika verzích komerčně dostupná metoda reverzní hybridizace na tzv. stripech (proužcích membrány, na kterých jsou fixované próby pro jednotlivé typy HPV, které následně hybridizují s produkty PCR a jsou vizualizovány kolorimetrickou detekcí), např. InnoLIPA belgické firmy Innogenetics.

Jinou hybridizační metodou, která není použitelná pro screening, ale používá se v případech, kdy je třeba přesně lokalizovat virovou DNA v buňce je ISH (In situ hybridizace), tedy hybridizace přímo v buňkách fixovaného tkáňového řezu na podložním skle.

Speciální metody

V případech atypických klinických nálezů cervikálních i ostatních, kde lze uvažovat o etiologické souvislosti s HPV a rutinní metodika není vhodná, se pro jejich detekci používají metody speciální, v naprosté většině případů amplifikační na základě použití polymerázové řetězové reakce – PCR.

Vzhledem ke specifitám PCR je třeba vyloučit přítomnost inhibitorů DNA polymerázy a současně ověřit dostatečné množství DNA vstupující do reakce amplifikací kontrolního genu např. pro lidský beta-globin. V případě úspěšné amplifikace tohoto tzv. kontrolního genu následuje PCR cílená na některou oblast papillomavirového genomu.

V případě, že amplifikace kontrolního genu neproběhne, následuje izolace, purifikace a zakoncentrování DNA ze vzorku a následně opět amplifikace kontrolního genu.

V případě negativního výsledku kontrolní amplifikace po purifikaci je vzorek označen jako neamplifikovantelný a doporučen nový odběr materiálu, v případě kladného výsledku následuje opět HPV PCR. Podle výchozího materiálu lze volit různé systémy primerů v PCR jednostupňové nebo nested, podle specifity degenerované, general nebo přísně specifické, ty případně i v multiplex reakci pro určení několika základních typů.

Výsledek PCR se vizualizuje buďto pomocí elektroforézy, zde obvykle následuje ještě konfirmace některou z hybridizačních metod, která současně zvýší citlivost detekce, např. metodou Southern-blotu, nebo přímo metodou hybridizace a imunochemické detekce na mikrotitračních destičkách.

V případě pozitivního výsledku obvykle následuje některá z metod určení HPV typu. Použít lze například PCR s typově specifickými primery, metodu RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism) založenou na rozlišení specifické délky restrikčních fragmentů, metodu hybridizace dot-blotu s typově specifickými oligopróbami, v současnosti více využívanou a v několika verzích komerčně dostupnou metodu reverzní hybridizace z dalších možností je možné uvést kapilární sekvenaci eventuelně s předchozím klonováním amplikonů, nebo metodu SSCP (Single strand conformation polymorphism).




Každá z metod má své výhody a svá rizika z hlediska citlivosti, specifity, diskriminace multiplicitní infekce, rizika kontaminace, falešně pozitivních nebo negativních výsledků apod., konečný výběr závisí vždy na účelu stanovení, přístrojových a prostorových možnostech laboratoře a zvážení rizik a výhod každé metody.

HPV asociované cervikální léze
HPV asociované cervikální léze
Mapa webu